显微镜是我们观察不可见世界的眼睛，揭示生命和物质的复杂细节。从最微小的微生物到复杂的材料结构，显微镜打开了我们曾经无法掌握的知识世界。
图1： 肉眼、光学显微镜和电子显微镜的分辨能力。
来源: 科学学习中心
显微镜之旅始于 16 世纪末，当时 撒迦利亚詹森荷兰眼镜制造商，被誉为第一台复式显微镜的发明者。这项开创性的发明为当今各种技术奠定了基础。这些技术因所用光的类型、图像形成方式和具体应用而有很大差异。
在这次探索中，我们将深入探索显微镜技术的迷人世界，揭示其基本原理、功能和局限性。通过了解不同方法的优缺点，研究人员可以选择最佳技术来揭开样本中隐藏的秘密。
1. 明场显微镜
图2： 明场显微镜光学装置（左）。洋葱细胞在有丝分裂的不同阶段的明场图像（右）。
来源： 显微镜俱乐部; 维基共享资源
明场显微镜是显微镜的一项基本技术，因其简单可靠而得到广泛应用。作为生物学和医学中最常用的方法之一，它能够对各种样本进行详细观察。
明场显微镜的工作原理是什么？明场显微镜采用一种基本的光学系统，其中光线由聚光镜聚集，穿过样本并进入物镜。最终图像的形成是由于样本对光线的吸收、反射和折射引起的光强度变化。这种对比机制使样本在明亮的背景下呈现深色，因此得名。明场显微镜最适用于具有足够对比度的薄而半透明的样本。这种对比度可能是样本固有的，例如天然色素沉着，也可能是通过染色技术人工增强的。
明场显微镜的应用明场显微镜的多功能性遍及众多领域。生物学家和医学家利用这项技术来检查细胞、组织和微生物。材料科学家也使用明场显微镜来分析材料的结构。
明场显微镜的局限性虽然明场显微镜对于具有足够对比度的样本很有效，但对于透明样本，它却存在挑战。该技术可视化细节的能力受到样本与其背景之间对比度的限制。
2. 暗视野显微镜图3： 暗场显微镜光学装置（左）。暗场图像 杜鹃 （正确的）。
来源： 显微镜俱乐部; 维基共享资源
与明视野显微镜不同，暗视野显微镜通过阻挡直射光到达物镜来创建醒目的图像。只有样本本身散射的光才能进入镜头，从而在黑暗的背景下形成明亮的样本。
暗视野显微镜的工作原理是什么？暗视野显微镜通过阻挡直射光到达标本来实现高对比度。使用特殊的聚光镜，光线从侧面照射到样品上，形成一个空心照明锥。当标本存在时，它会散射光线，使其进入物镜。这可以在黑暗的背景下产生明亮的标本图像，增强可见度，尤其是对于未染色和透明的样品。
暗视野显微镜的应用暗视野显微镜特别适用于观察活的、未染色的样本，例如细菌、原生动物和螺旋体。它也用于材料科学中检测小颗粒和缺陷。它可有效突出不透明样本的表面结构、缺陷和边界。
暗视野显微镜的局限性暗背景会使观察标本的精细细节变得困难，而灰尘和碎屑可能会变成明亮的物体，从而可能遮挡样品。此外，暗场所需的高光强度可能会损坏敏感的标本。
3. 相差显微镜相差显微镜是一种强大的技术，可用于观察透明样本（如活细胞），这些样本在明场显微镜下对比度不足。相差显微镜利用了样本内不同结构具有不同折射率这一事实，从而导致光线以不同的速度穿过它们。
相差显微镜如何工作？使用特殊的聚光镜和物镜将相位差（人眼不可见）转换为振幅差（以亮度变化的形式可见）。这可以增强样本的对比度，而无需染色。
相差显微镜的应用相差显微镜广泛应用于细胞生物学，用于研究活细胞、观察细胞内结构和监测动态过程。它还用于微生物学，用于检查细菌和其他微生物。
相差显微镜的局限性相差图像通常会在结构边缘周围出现光晕伪影，从而掩盖细节。与明场显微镜相比，物镜中的相位环会略微降低整体分辨率。由于需要专门的相差物镜和聚光镜，因此与标准明场光学系统相比，它的成本也更高。
图4： 明场（左）和相差（右）中的人类神经胶质细胞图像。
来源： 显微镜
4. 微分干涉 (DIC) 显微镜图5： 人类颊粘膜上皮细胞 (a, b)、鼠肾组织厚切片 (c, d) 和 Obelia 息肉状环状茎周围组织的 DIC (a, c, e) 和相位对比 (b, d, f) 图像
来源： 奥林巴斯生命科学
微分干涉对比 (DIC) 显微镜，也称为诺马斯基干涉对比，是一种先进的技术，可产生透明样本的惊人、几乎 3D 图像。它擅长揭示样本内折射率的细微变化。
DIC 显微镜如何工作？DIC 采用偏振光和一系列光学元件来产生两束略微偏移的光束，这些光束穿过标本。由于标本折射率的变化，两束光束之间的光路长度不同，从而产生干涉图案，从而生成图像。
DIC 显微镜的应用DIC 特别适用于研究未染色的生物样本，例如活细胞、胚胎和微生物。该技术在材料科学中也很有用，可用于检查透明或半透明材料。
DIC 显微镜的局限性DIC 显微镜最适合用于折射率变化细微的薄透明样品。对于较厚的标本（例如组织切片或色素沉着较强的标本），其有效性会大大降低。由于 DIC 需要专门的光学元件，因此会增加显微镜系统的整体成本。
5. 宽场荧光显微镜宽视野荧光显微镜是一种基本技术，它用激发光照亮整个样本，以观察荧光标记的结构。
创新中心 宽场荧光显微镜 作品？当荧光团吸收特定波长的光（激发）并发射更长波长的光时，就会产生荧光。为了使目标分子可视化，荧光团结合探针（如抗体或核酸探针）用于专门标记感兴趣的成分。然后用激发光照射样品，发射的荧光由物镜收集。滤光片选择性地透射发射光，同时阻挡激发光，从而产生荧光结构在黑暗背景下显得明亮的图像。
的应用 宽场荧光显微镜宽视野荧光显微镜广泛应用于生物研究，用于免疫荧光染色以检测和定位特定蛋白质。它还用于原位杂交以研究基因表达模式，以及用于细胞成像以可视化细胞结构和动态。
限制 宽场荧光显微镜虽然用途广泛，但宽视野荧光显微镜仍存在一些局限性。焦平面上方和下方区域发出的光会产生背景噪音，降低图像清晰度和对比度，尤其是在厚样本中。长时间暴露在激发光下会损坏感光样本。荧光团浓度低会导致荧光信号弱。
6. 共聚焦显微镜图7： 用 DAPI（核 DNA-蓝色）、Alexa 3-鬼笔环肽（肌动蛋白丝菌株-绿色）和 MitoTracker Red（线粒体-红色）标记的上皮细胞的宽视野显微镜（a、c 和 e）和共聚焦显微镜（b、d 和 f）的 488D 图像（a、b），用 DAPI（核 DNA-蓝色）、Alexa 20-麦胚凝集素（膜染色-绿色）和 Alexa 488-鬼笔环肽（肌动蛋白丝染色-红色）标记的约 568 μm 厚的小鼠肾脏切片（c、d），以及厚度约为 3 μm 的 MCF-10A 乳腺上皮细胞球体的 50D 培养物，用核绿色荧光蛋白融合和红色荧光蛋白融合标记膜（e、f）。
资料来源：doi： 10.7171/jbt.15-2602-003
共聚焦显微镜是一种强大的技术，它通过显著提高图像分辨率和对比度克服了宽视野荧光显微镜的局限性。
共聚焦显微镜如何工作？共聚焦显微镜使用激光逐点扫描样本。探测器前面有一个针孔，只允许检测从焦平面发出的光。这有效地消除了失焦光，从而产生更清晰的图像。
共聚焦显微镜采用多种技术来实现高分辨率成像：
激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）： 这是最常用的方法，利用聚焦激光束逐点扫描样本。虽然这种方法可以提供出色的图像质量，但可能非常耗时，尤其是对于大型样本或实时成像。 转盘共聚焦显微镜： 该技术利用带有多个针孔的旋转盘同时照亮样品的不同部分，从而加速图像采集。因此，它通常是活细胞成像等动态过程的首选。 可编程阵列显微镜（PAM）： 它与旋转盘类似，采用图案化针孔阵列，但在控制照明模式方面具有更大的灵活性。然而，与其他两种相比，这种共聚焦显微镜的使用范围较小。
共聚焦显微镜的应用共聚焦显微镜广泛应用于生物和生物医学研究，用于研究细胞结构、蛋白质定位和动态过程。由于其能够创建光学切片，因此对于成像厚样本（如组织和胚胎）特别有价值。
共聚焦显微镜的局限性虽然共聚焦显微镜比传统的宽视野显微镜具有显著的优势，但它也有一些局限性。由于共聚焦显微镜的点扫描特性，获取图像的速度可能很慢，尤其是对于大型数据集或高分辨率成像。共聚焦显微镜中使用的强激光会损坏或漂白荧光样品，限制观察时间并影响数据质量。共聚焦显微镜的购买和维护成本高昂，需要专门的设备和训练有素的人员。
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7. 多光子/双光子显微镜
图7： 共聚焦显微镜与双光子激发显微镜的比较。（右）用荧光素染色的鲨鱼脉络丛图像。 共焦图像 (A) 的对比度在 70 µm 时显著降低，而双光子激发即使在 140 µm 时也能收集具有出色强度对比度的图像。（左）
资料来源：doi： 10.1371 / journal.pbio.0030207
多光子显微镜或双光子显微镜是一种先进的成像技术，其功能超越了传统共聚焦显微镜。它能够更深地穿透组织并降低光毒性，使其成为研究生物系统的宝贵工具。
多光子显微镜如何工作？多光子显微镜不使用单个光子来激发荧光团，而是使用两个或多个光子同时撞击荧光团，使其发射能量更高的单个光子。由于激发光处于红外光谱中，因此与共聚焦显微镜中使用的可见光相比，它可以更深地穿透组织，从而能够对较厚的样本进行成像。由于激发光的能量较低，样本受到光损伤的风险显著降低。
多光子显微镜的应用多光子显微镜因其独特的特性，在对厚活体标本进行成像方面表现出色。由于它能够深入组织，因此适合用于脑结构、胚胎发育和器官生理学的非侵入性研究成像。由于其光毒性较低，它能够对活细胞进行成像并长期观察动态细胞过程，而不会造成重大损害。它还提供了可能性 体内 成像来研究完整生物体（例如疾病的动物模型）中的生物过程。
多光子显微镜的局限性由于需要专业设备，包括高功率飞秒激光器和灵敏探测器，多光子显微镜成为一项成本高昂的技术。虽然比共聚焦显微镜更深，但穿透深度仍然受到组织内光散射和吸收的限制。并非所有荧光团都能有效进行双光子激发，这限制了标记剂的选择。
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8. 全内反射荧光 (TIRF) 显微镜图8： 落射荧光和 TIRF 照明的物理基础（A、B）。
使用落射荧光和 TIRF 获得的图像比较（C、D）
资料来源： 10.1242/jcs.056218
TIRF 显微镜是一种特殊的荧光技术，可为细胞表面附近发生的成像过程提供出色的灵敏度和空间分辨率。
TIRF 显微镜如何工作？当光在两种折射率不同的介质（例如玻璃和水）的界面上发生全内反射时，会产生衰减波。该波会穿透第二介质一小段距离（通常为 100-200 纳米）。只有衰减场内的荧光团被激发，从而最大限度地减少了来自本体溶液的背景荧光。这可实现高信噪比。
TIRF 显微镜的应用TIRF 在可视化膜动力学方面非常有用，例如受体-配体相互作用、囊泡和蛋白质运输、内吞作用、病毒感染、细胞表面的细胞-底物相互作用或细胞骨架动力学。
TIRF 显微镜的局限性TIRF 显微镜的一个缺点是必须使用贴壁培养细胞，这限制了其在悬浮细胞或某些类型组织中的使用。
9. 超分辨率显微镜图9： U2OS 细胞的活细胞 TauSTED 图像，使用肌动蛋白 (SiR-actin，发光)、微管 (SPY555-tubulin，青色) 和膜 (CF488A 与 WGA 偶联，绿色) 的标签。
来源: 徕卡
超分辨率显微镜是一系列超越传统光学显微镜分辨率限制的衍射极限的技术。这一开创性的领域彻底改变了我们对细胞和分子过程的理解。
超分辨率显微镜如何工作？衍射极限是光的波动性所造成的物理限制，它将传统光学显微镜的分辨率限制在约 200 纳米。超分辨率技术采用各种策略来规避这一限制，从而实现纳米级（5-20 纳米）成像。通常，超分辨率技术涉及在样本内精确定位荧光团，以及计算重建以结合来自多个帧或测量的信息来创建高分辨率图像。通过操纵荧光团的发射特性或使用结构化照明，这些技术可以绕过光波长造成的限制。
目前已开发出多种超分辨率技术，每种技术都有其独特的方法：
受激发射损耗（STED）： 采用第二束激光将荧光发射限制在一个很小的区域内，从而有效提高分辨率。 结构照明显微镜 (SIM)： 使用图案照明来生成干涉图案，以增强图像细节。 光激活定位显微镜 (PALM) 和 随机光学重建显微镜 (STORM)： 依靠对单个荧光团的开启和关闭进行控制来精确确定它们的位置。
超分辨率显微镜如何工作？超分辨率显微镜已在纳米级的众多领域得到广泛应用。这些应用包括研究细胞结构的组织和分子相互作用的动态、对突触和神经元网络的精细结构进行成像、表征纳米材料及其特性以及研究疾病的分子基础。
超分辨率显微镜的局限性？超分辨率显微镜虽然能够提供前所未有的细节，但也面临一些挑战。随着分辨率的提高，技术要求和限制也变得更加明显。其中包括需要专门的荧光团、易受振动等环境因素的影响以及光毒性的可能性。此外，超分辨率系统复杂且昂贵，通常需要在设备和专业知识方面进行大量投资。在对更高分辨率的渴望与样品完整性和成本效益等实际考虑之间取得平衡，对于成功的超分辨率成像至关重要。
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参考文献：
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https://www.leica-microsystems.com/science-lab/super-resolution-microscopy-image-gallery